Koncom osemdesiatych rokov ako pokročilá laserová konfokálna mikroskopia má však veľkú chybu: konfokálna apertúra nielen blokuje fluorescenciu generovanú mimo ohniska, ale blokuje aj fluorescenciu generovanú ohniskom, ktoré je rozptýlené biologickými tkanivami, čo vedie k zníženiu účinnosti zberu fluorescencie a hĺbka zobrazenia nemôže byť väčšia ako 100 mikrometrov. Preto v 90. rokoch minulého storočia vznikla dvojfotónová fluorescenčná mikroskopia kombinujúca laserovú konfokálnu mikroskopiu a technológiu dvojfotónovej excitácie. Excitačná vlnová dĺžka procesu dvojfotónovej absorpcie je vo všeobecnosti nastavená v rozsahu biooptického okna 680-1080 nm, čo zabraňuje poškodeniu buniek alebo živých organizmov ultrafialovým svetlom a preniká hlbšie.
V súčasnosti je najpoužívanejším dvojfotónovým fluorescenčným mikroskopom femtosekundový titánový drahokamový laser, ktorý je objemný a drahý, čo obmedzuje použitie dvojfotónovej fluorescenčnej mikroskopie v rôznych oblastiach, ako sú biologické vedy, chémia a medicína. Takže v niektorých oblastiach, ako je lekárska diagnostika, sa ľudia pokúšali použiť kompaktné a cenovo dostupné subnanosekundové pevnolátkové lasery ako štandardný zdroj svetla.
Základným princípom dvojfotónovej excitácie je, že keď je fluorescenčná molekula excitovaná pri vysokej hustote fotónov, súčasne absorbuje dva fotóny s dlhou vlnovou dĺžkou a potom spontánne vyžaruje fluorescenčné fotóny späť do základného stavu po excitačných skokoch a relaxačných procesoch. V porovnaní s bežnou jednofotónovou excitačnou fluorescenčnou mikroskopiou je generovanie optického signálu v dvojfotónovej excitačnej fluorescenčnej mikroskopii nelineárne, pričom excitačné svetlo je svetelný zdroj s dlhšou vlnovou dĺžkou a vyšším špičkovým výkonom a emitované fluorescenčné fotóny majú vlnovú dĺžku. o niečo dlhšie ako polovica excitačnej vlnovej dĺžky.
Dvojfotónová fluorescenčná mikroskopia využíva zdroj blízkeho infračerveného laserového svetla a jej nelineárna povaha nevyžaduje konfokálnu apertúru. Preto má dvojfotónová fluorescenčná mikroskopia v porovnaní s konfokálnou mikroskopiou nasledujúce výhody:
- Veľká hĺbka zobrazenia a nízke optické poškodenie;
- Nie je potrebná žiadna konfokálna apertúra a účinnosť zberu fluorescencie je výrazne zlepšená;
- Vyššie priestorové rozlíšenie a kontrast;
- Malý rozsah excitácie, malá fototoxicita a bielenie;
- Emisné a excitačné vlnové dĺžky sú ďaleko od seba, čím sa zabráni spektrálnemu prekrývaniu;
